Fatores que influenciam a estabilidade
das nanopartículas de prata dispersas em própolis
Factors that influence the
stability of silver nanoparticles dispersed in propolis
Factores
que influyen en la estabilidad de las nanopartículas de plata
dispersas en el propóleo
Mayara Santana dos Santos
1;
Bianca Pizzorno Backx2
1Graduanda em Ciências Biológicas:
Biotecnologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Duque de Caxias, Rio de
Janeiro, +55 21 995056096, contatomayaras@gmail.com; 2Doutora em Engenharia Metalúrgica e de Materiais
e Professora Adjunta da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Duque de
Caxias, Rio de Janeiro, biapizzorno@caxias.ufrj.br
Recebido: 04/04/2020;
Aprovado: 10/08/2020; Publicado: 16/09/2020
Resumo: A
própolis é um material resinoso de composição peculiar que estimula variados
questionamentos desde as civilizações antigas. Essas indagações estão
relacionadas às diferentes propriedades associadas à própolis, como as
atividades antioxidantes, antimicrobianas, antivirais, antimutagênicas,
anti-inflamatórias, cicatrizantes, dentre outras. Desta forma, essas
propriedades presentes na própolis estão sendo empregadas em produtos bionanotecnológicos por conta, por exemplo, do seu alto
teor de flavonoides e substâncias fenólicas que atuam em sinergia com as
propriedades encontradas nas nanopartículas de prata. Neste artigo, diferentes
fatores físico-químicos que podem influenciar a estabilidade das nanopartículas
de prata dispersas na própolis serão discutidos. As caracterizações por
espectrofotometria no ultravioleta e visível definem a estabilidade do nanossistema coloidal.
Palavras-chave: Biotecnologia;
Nanopartículas; Nanotecnologia; Espectrofotômetro no UltraVioleta
e Visível.
Abstract: Propolis is a resinous
material with a peculiar composition that stimulates several questions since
ancient civilizations. These
questions are related to the different properties of propolis, such as
antioxidant, antimicrobial, antiviral, antimutagenic, anti-inflammatory, and
healing activities. Thus, these properties present in
propolis are being used in bio-nanotechnological products due, for example, to
their high content of flavonoids and phenolic substances that act in synergy
with the properties found in silver nanoparticles. In this article, different
physical-chemical factors that can influence the stability of silver
nanoparticles dispersed in propolis will be discussed. Characterizations by
visible ultraviolet spectrophotometry define the security of the colloidal nanosystem.
Keywords: Biotechnology; Nanoparticles; Nanotechnology;
Spectrophotometer Ultraviolet-Visible.
Resumen: El propóleo es un
material resinoso con una composición
peculiar que estimula varias
preguntas desde civilizaciones antiguas.
Estas preguntas están relacionadas con las diferentes propiedades del propóleo, como las actividades antioxidantes, antimicrobianas, antivirales, antimutagénicas, antiinflamatorias y cicatrizantes. Así,
estas propiedades presentes en
el propóleo se están utilizando en productos bio-nanotecnológicos debido, por ejemplo, a su alto contenido en flavonoides y sustancias
fenólicas que actúan en
sinergia con las propiedades que se encuentran en las nanopartículas de plata. En este artículo se discutirán diferentes factores
físico-químicos que pueden influir en la estabilidad
de las nanopartículas de plata
dispersas en el propóleo. Las caracterizaciones
por espectrofotometría ultravioleta visible definen la seguridad del
nanosistema coloidal.
Palabras Clave: Biotecnología;
Nanopartículas; Nanotecnología; Espectrofotómetro
Ultravioleta-Visible.
INTRODUÇÃO
A própolis é uma substância peculiar
de composição resinosa produzida exclusivamente a partir do trabalho sinérgico
realizado pelas abelhas (SFORCIN, 2016). É uma mistura confeccionada a partir
de diferentes substâncias resinosas advindas de estruturas vegetais, secreções
glandulares e salivares emitidas pelas abelhas. A própolis também contém óleos
essenciais, ceras e possíveis grão de pólen consequentes da polinização
(LUSTOSA et al., 2008).
Esta
substância possui diversas aplicabilidades dentro e fora da colmeia, como
material de proteção contra possíveis predadores e a variadas temperaturas, pois
é um material rígido e resistente (ANJUM et al., 2019). A própolis também é utilizada
na colmeia como material antisséptico para evitar possíveis contaminações
(FUNARI; FERRO, 2006).
Além das funcionalidades naturais
empregadas na colmeia, a própolis pode gerar inúmeras possibilidades de
aplicações terapêuticas devido às suas propriedades biológicas, como as
atividades antimicrobianas, antivirais, anti-inflamatórias, antitumorais,
antimutagênicas, antioxidantes, cicatrizantes, analgésicas, dentre outras propriedades
(DOS SANTOS; BACKX, 2019).
Neste sentido, a própolis pode obter
uma sinergia e potencialização de suas propriedades biológicas quando for
associada às nanopartículas metálicas, por exemplo, as nanopartículas de prata
(AgNPs). Essa sinergia é ocasionada por conta dos variados compostos orgânicos
e moléculas presentes na própolis, como o seu alto teor em flavonoides, assim
como os ácidos fenólicos que influenciam em suas atividades antibacterianas,
antifúngicas, antivirais e, principalmente, em suas ações antioxidantes (AHMED
et al., 2017). Esses compostos orgânicos (ZHANG et al., 2016) são essenciais para
rotas verdes de AgNPs, porque o meio redutor é necessário para a eficiência e
estabilização da síntese de nanopartículas (TAQI et al., 2020).
As AgNPs alcançaram um amplo enfoque
em pesquisas científicas de diferente áreas de atuação devido às suas
possibilidades de aplicações transdisciplinares (ANTUNES FILHO; BACKX, 2020). Dentre as variadas áreas, o setor medicinal é o mais
crescente em pesquisas científicas devido ao seu propósito basal de empregar e
aprimorar as propriedades advindas das AgNPs, como a administração de fármacos
de ação direcionada, o desenvolvimento de dispositivos médicos, tecidos
funcionais, terapia gênica, dentre outras finalidades (KANWAL et al., 2019).
Essa diversidade de aplicações das
AgNPs deve-se a fatores associados ao seu tamanho, formato e a dispersão
coloidal que estão atreladas às suas atividades biológicas (RODRIGUES et al.,
2019), por exemplo, as antimicrobianas, antivirais, antioxidantes,
antitumorais, anti-inflamatórias, entre outras (DURÁN et al., 2018).
A síntese de AgNPs pode ser
realizada a partir de diversas metodologias, entretanto, a biossíntese é a
técnica mais adequada de sintetizar AgNPs (LEE; JUN, 2019). Neste método, a
utilização de reagentes tóxicos que prejudiquem o meio ambiente, bem como a
saúde humana e animal não se tornam necessários (JASUJA et al., 2014), pois são
utilizados insumos orgânicos de origem vegetal ou animal, por exemplo, a
própolis (DOS SANTOS et al., 2019).
O mecanismo associado a biossíntese
das AgNPs em extrato hidroalcoólico de própolis se dá nas seguintes etapas: Um
precursor de prata, normalmente, um sal inorgânico de nitrato de prata (AgNO3)
é submetido à um extrato hidroalcoólico de própolis (DOS SANTOS; BACKX, 2019). Ocorre a dissociação iônica capaz de promover a
formação de íons prata em solução. Com o meio dispersivo rico em substâncias
antioxidantes, ocorre a promoção dos íons prata a prata no estado fundamental (ANTUNES FILHO et al., 2020). Assim, os átomos de prata presentes em solução iniciam uma
cinética de nucleação e crescimento até a formação e estabilização das AgNPs (PRASAD,
2014; REIMERS et al., 2017; LI et al., 2018).
Há diferentes métodos para verificar
a formação das AgNPs. A observação da mudança de coloração da solução coloidal é
o passo preliminar para identificar as características do nanossistema. Desta
forma, a alteração na cor da solução pode indicar certas características, como
o estado de agregação, tamanho e possíveis oxidações das nanopartículas (SHARMA
et al., 2012). As cores podem variar entre o incolor, amarelo, laranja, violeta
e cinza. Na literatura já existem estudos que associam coloração da solução
coloidal e o grau de associação das AgNPs. Está estabelecido que a cor amarela
indica a formação de poucas ou ausentes agregações entre as nanopartículas de
prata e seu meio dispersivo, enquanto que a cor cinza demonstra
o maior estado de agregação (MELO JR. et al., 2012).
Como se estabelece uma dispersão
coloidal no nanossistema estudado, um protocolo prático que ratifica a formação
de uma dispersão coloidal de AgNPs se dá pela avaliação do efeito Tyndall. Através
da passagem do feixe do laser de um simples pointer, uma porção da luz é
dispersa pelas nanopartículas presentes na solução conduzindo a uma divergência
do feixe de luz (LIAW et al., 2012).
Esta observação confirma que a rota de síntese gerou uma dispersão
coloidal efetiva. Desta forma, é possível avançar com os outros protocolos de
caracterização. Com este teste, o tempo e investimento das experimentações são
poupados, caso a síntese não seja eficiente.
Para caracterizar as soluções
coloidais obtidas na biossíntese é utilizado o espectrofotômetro no Ultravioleta
e Visível (UV/Vis). Essa técnica analítica estuda o comportamento dos
comprimentos de onda, frequência e amplitude (ROCHA; TEIXEIRA, 2004). Desta
forma, a partir dessa análise é possível medir a absorção emitida pela radiação
eletromagnética em regiões visíveis através do ultravioleta que quantifica as
espécies químicas, como íons e moléculas em solução (REDASANI et al., 2018).
Esses resultados projetados estão
associados ao fenômeno de Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), dado que
as nanopartículas apresentam uma razão superfície/volume diferenciada (SANTOS
et al., 2016). O efeito de SPR, do inglês surface
plasmon resonance, é
estudado por meio da técnica de espectrofotometria de UV/Vis. Ocorre em
soluções coloidais de AgNPs onde através da incidência da luz há diminuição da
dispersão de elétrons na superfície das nanopartículas após absorções químicas
de Ag+ na superfície e na transição da banda de SPR revelando um
pico entre 380 e 480 nm (YANG et al., 2016). A transição de SPR depende fortemente
das funções dielétricas do meio dispersivo (LINIC et al., 2015). Enquanto, o
formato da banda de indica a distribuição e tamanho das nanopartículas de prata
(ARVISO et al., 2012). Esta técnica analítica permite avaliar as
características de dispersão das AgNPs na dispersão coloidal. O acompanhamento
desta dispersão é imprescindível para o entendimento da estabilidade do sistema
coloidal.
Os nanossistemas
ou dispersões coloidais são definidos como sistemas nos quais um ou mais componentes apresentam suas dimensões dentro do intervalo de 1 nm a 100 nm. As dispersões coloidais referem-se aos coloides
formados por aglomeração de moléculas simples (PHU et al., 2010). Este é um
processo termodinâmico, onde inicialmente ocorre a nucleação (formação dos
núcleos de crescimento e estabilização das partículas) e o crescimento
(agregação de novos particulados na superfície desses núcleos para
estabilização da matriz coloidal).
A busca de dispersões coloidais
estáveis se estabelece no processo de síntese verde de nanopartículas de prata
presente neste estudo. As dispersões coloidais, que são termodinamicamente
irreversíveis e instáveis devido a sua alta tensão na interface do particulado
e meio dispersivo, apresentam forte tendência a crescer indefinidamente e a
coalescer para diminuir sua energia interfacial, o que os leva a se separar em
fases macroscópicas novamente. Desta forma ocorre a inativação do sistema em nanoescala
e a dispersão final não é nanotecnológica. Este
sistema não é eficiente para as dispersões das nanopartículas (POLTE et al., 2012).
O sistema coloidal é estabelecido
quando as partículas metálicas são protegidas por substâncias do meio
dispersivo, estabelecendo uma relação estável entre o núcleo e o meio
dispersivo polar (BADAWY et al., 2010). Um meio dispersivo verde é aquele
obtido pela extração aquosa ou hidroalcóolica, logo um meio polar, com
componentes orgânicos de extratos naturais e apresenta uma organização definida
pela dispersão homogênea das nanoestruturas no meio dispersivo.
A estabilidade intrínseca nestes
sistemas se dá principalmente pela eficiente dispersão de partículas em função
do tamanho. Logo o estudo da estabilidade em função do tempo, influência de
luz, pH, meio antioxidante, temperatura, entre outros, se faz importante para o
entendimento destes nanossistemas (MOORE et al.,
2015). Se a síntese de nanopartículas
promove baixo número de monômeros, logo há diminuição do tamanho das
nanopartículas, ocorrendo o aumento de substâncias apolares na interface de
separação. Assim sendo, o valor ótimo para o raio de uma micela é
aproximadamente o valor do comprimento da cadeia da molécula orgânica do meio
dispersivo.
Esta interação é estabelecida por
forças de interações intermoleculares, tais como Van Der Waals,
que estabelecem um sistema estável entre o meio dispersivo e as nanopartículas
e as moléculas orgânicas extraídas se estabelecem em um equilíbrio supramolecular
para estabelecer um sistema eficiente e estável (CAI et al., 2018).
Fatores relacionados à agitação
térmica e repulsão elétrica por formações de cargas parciais superficiais
diminui a agregação de nanopartículas, sendo estes fatores essenciais no estudo
de estabilidade da matriz coloidal do nanossistema estudado no presente artigo.
Além deste fator, uma extração não controlada em função principalmente da
temperatura, aumenta a concentração de substâncias orgânicas polares o que
dificulta a formação de micelas, porque aumenta a solubilidade molecular. Logo,
o controle efetivo de parâmetros de extração para síntese de um meio dispersivo
eficiente é fundamental para que o sistema nanométrico estabelecido tenha
eficiência e estabilidade.
O objetivo do trabalho consiste em
investigar os fatores físico-químicos presentes na síntese e armazenamento da
solução de AgNPs feitas com o extrato hidroalcoólico de própolis que podem
influenciar na estabilidade das AgNPs em um sistema coloidal.
MATERIAL E
MÉTODOS
As
amostras de própolis de Apis mellifera
foram coletadas em Afonso Arinos (22°01'04.8" S e 43°20'01.8" W),
localizada em Três Rios, região serrana do Rio de Janeiro, Brasil. O referido município possui um bioma de Mata
Atlântica com o clima de tropical úmido.
Na preparação do extrato
hidroalcoólico de própolis chamado de solução mãe (SM) foram utilizadas
variadas massas de própolis buscando no estudo uma massa ótima para obtenção de
um meio dispersivo eficiente como 2,0 g, 0,5 g e 0,1 g de própolis, além de
água deionizada e álcool etílico a 95% (v/v). Após o preparo, o extrato foi
submetido ao aquecimento em uma chapa aquecedora a 60°C. Para a síntese das AgNPs,
o precursor utilizado é o sal inorgânico nitrato de prata (AgNO3) em
meio aquoso com concentração de 0,01 M.
Na síntese
da solução de AgNPs foram utilizados como reagentes, em uma proporção de 2:1, o extrato hidroalcoólico de própolis e
a solução de nitrato de prata aquoso, respectivamente. A solução de AgNPs foi
submetida a aquecimento por 60ºC para aumentar a cinética da reação e favorecer
a interação entre os componentes da solução.
As amostras de AgNPs analisadas no
teste de estabilidade em relação aos dias, temperaturas e exposição a luz foram
armazenadas com a mesma concentração de 2 mL em um Eppendorf®. Desta forma, as amostras foram direcionadas a um
refrigerador a 4°C, uma estufa de esterilização e secagem analógica a 40°C e
sob a bancada de experimentos com média de 25°C. Para mensurar as temperaturas
foi utilizado um termômetro digital.
Todas as soluções de AgNPs foram submetidas
ao espectrofotômetro de UV/Vis Thermo Scientific Evolution 60S para observar a formação de
nanopartículas de prata através da presença do pico de SPR. Para realizar as
medidas espectroscópicas foi utilizado uma cubeta de quartzo no interior do
espectrofotômetro de UV/Vis para medir os comprimentos de onda do branco
(extrato hidroalcoólico de própolis) e da amostra (solução de AgNPs) com
varredura de 190nm a 1100nm (CHAMBERLIN
et al., 2008).
Após
a caracterização das AgNPs, no espectrofotômetro de UV/Vis foi possível obter
variados espectros de absorbância referentes ao pico de SPR associado as AgNPs,
sendo assim a análise dos resultados possibilitou estabelecer relações entre a
estabilidade das soluções de AgNPs em função dos comprimentos de onda e
absorbância. Além disso, os valores de absorbância dos variados comprimentos de
onda emitidos no espectrofotômetro de UV/Vis foram tratados no Excel 2016 para
construção dos gráficos de dispersão.
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Foram
testadas diferentes concentrações de própolis para a síntese do meio dispersivo
das AgNPs para analisar a influência dessa substância no sistema coloidal. Na
literatura é abordado que diferentes concentrações de própolis podem
influenciar as características dispersivas das nanopartículas (DOS SANTOS;
BACKX, 2019). A partir da caracterização por espectrofotometria de UV/Vis é
possível analisar se houve aglomeração de nanoestruturas (MA et al., 2017) através do comprimento de onda presente na Figura 1A,
Figura 1B e Figura 1C.
O pico de SPR encontrado nas
amostras de extrato hidroalcoólico com 2,0g e 0,5g de
própolis na Figura 1A e na
Figura 1B podem indicar uma morfologia e estados de agregação de
nanopartículas diferentes do que é observado no pico de SPR da Figura 1C devido ao perfil espectral
com maior largura a meia altura. De acordo com a literatura, a
agregação das nanopartículas são sinalizadas pelo tamanho do intervalo
da largura da curva do pico de SPR (ARVISO et al., 2012). Neste sentido, quanto
maior for à agregação de AgNPs ou maior for as
variações morfológicas das mesmas, maior será a
largura da banda do pico de SPR, ou seja, maior será a variação do seu
comprimento de onda. Essas possíveis maiores aglomeração de nanoparticulados
podem ser justificadas através de dados encontrados na literatura que
evidenciam a grande quantidade de moléculas oriundas da própolis presentes no
meio dispersivo como os ácidos fenólicos, flavonoides, dentre outras moléculas
que promovem um incremento nas interações supramoleculares aumentando desta
forma a aproximação das micelas presentes no sistema coloidal estabelecido (MARCUCCI et al.,
2001; BADAWY et al., 2010; MOORE et al.,
2015).
Figura 1.
Caracterização no espectrofotômetro de UV/Vis feito a partir de uma solução de
AgNPs sintetizada em meio dispersivo de própolis com variadas massas. (A)
Solução de AgNPs sintetizada com 2,0 g de própolis. (B) Solução de AgNPs
sintetizada com 0,5 g de própolis. (C) Solução de AgNPs sintetizada com 0,1 g
de própolis.
Desta forma é possível analisar que
o sistema, com excesso de moléculas longas que foram extraídas da própolis,
acaba por inibir a eficiência do sistema coloidal, pois promove, através da
química supramolecular do meio dispersivo, a perda da estabilidade da matriz
coloidal.
Diante disto, é necessário
investigar e compreender o comportamento dos picos de SPR que as AgNPs
apresentam no espectrofotômetro de UV/Vis e relacioná-los a sua dispersão e
estabilidade. Um comportamento associado a um estado de agregação e dispersão
eficiente está associado à banda de SPR da amostra da Figura 1C, que apresentou
a largura do pico de SPR entre o espectro de 380 e 550 nm. De acordo com o estado
da arte, dentre a Figura 1A,
Figura 1B e Figura 1C, o espectro da Figura 1C consiste na melhor e mais
relevante rota de síntese devido a boa dispersão e eficiência do comprimento de
onda do espectro (YANG et al., 2016).
Além de testar diferentes
concentrações de própolis presentes no extrato hidroalcoólico, foram testados
variados tempos de aquecimento da solução de AgNPs utilizando o extrato
hidroalcoólico com 0,1g de própolis. O propósito da experimentação associada à
temperatura de preparo da solução consiste na seguinte premissa: observar se a
energia térmica inserida no sistema influencia na formação de AgNPs. Isto
porque uma vez que a temperatura influencia na energia cinética das moléculas e
particulados presentes na dispersão, será possível estudar se o aumento da
energia vibracional molecular implicará num nanossistema eficiente (PARESQUE et al., 2019), além de ser possível verificar maior ou menor agregação,
influenciando diretamente na observação referente a tamanho e dispersão do nanossistema
associada a banda de SPR (POLTE et al., 2012). Sendo assim, foram testadas
diferentes temperaturas de aquecimento da SM juntamente ao AgNO3
disperso em meio aquoso como 3, 5 e 7
minutos organizados na Figura 2. A absorbância e comprimento de onda do branco
denominado de SM foram medidos para indicar a utilização do mesmo extrato
hidroalcoólico de própolis para cada rota de síntese.
Através da experimentação juntamente
aos conceitos presentes na literatura sobre energia e sistema dispersivo (WANG et al., 2017) foi possível ratificar que a energia térmica adicionada nas
amostras tem influenciado o perfil do pico de SPR apresentado na Figura 2, ou
seja, o aquecimento agita as moléculas propiciando a interação das espécies
químicas presentes na própolis com AgNO3 disposto em meio aquoso. A
cinética envolvida nessa reação pode influenciar a formação das AgNPs, como evidenciado na solução de AgNPs
com 7 minutos de aquecimento, enquanto nos tempos de aquecimento de 3 e 5
minutos não obtiveram energia térmica suficiente para formar as AgNPs.
Para aplicabilidade a solução de AgNPs é necessário investigar e conhecer suas propriedades
ao longo do tempo. Desta forma, se torna necessário estudos de estabilidade,
temperatura de armazenamento e exposição a luz em função do tempo. As soluções
foram submetidas a diferentes temperaturas com e sem exposição de luz ao longo do
dia 0, 5 e 7: geladeira a 4°C, temperatura ambiente a 25°C e estufa a 40°C.
Os picos de SPR sobrepostos encontrados nas soluções de AgNPs da Figura 3A, Figura 3B e Figura 3C indicam uma
característica em comum, o crescimento das AgNPs ao
longo dos dias devido ao aumento no espectro do comprimento de onda dos picos
de SPR.
Na Figura 3A, ao comparar o pico de SPR da solução AgNPs do dia 0 ao dia 7 com as Figura 3B e Figura 3C é
possível compreender que houve uma maior estabilização e menor variação na morfologia
das nanopartículas no decorrer do tempo. Por apresentar o mesmo comportamento,
é possível observar que os picos de SPR estão sobrepostos (solução de AgNPs com exposição a luz, linha verde, e sem exposição a
luz, linha azul) estão relacionados com a cinética da temperatura de
armazenamento; neste caso, a temperatura mais baixa (4°C) auxilia na baixa
agregação das nanopartículas e estabiliza mais eficientemente a solução
coloidal ao longo do tempo do que as temperaturas mais altas (25°C e 40°C). Este
fenômeno está intrinsecamente relacionado à diminuição da energia vibracional
molecular, conferindo desta forma, uma maior estabilidade do sistema coloidal
(PHU et al., 2010). Outro fator que contribui para o entendimento desse
resultado é o perfil do pico de SPR que apresenta menor largura e intensidade
na Figura 3A.
