ARTIGO CIENTÍFICO

Identificação de famílias F_2:3 de tomateiro homozigotas resistentes à Ralstonia pseudosolanacearum e Ralstonia solanacearum

Identification of families F_2:3 of homozygous tomatoes resistant to Ralstonia pseudosolanacearum e Ralstonia solanacearum

Kleyton Danilo da Silva Costa^1*, Ana Maria Maciel dos Santos², Paulo Ricardo dos Santos³, Adriano Márcio Freire Silva⁴, Eduardo Pereira de Sousa Neto⁵, José Luiz Sandes de Carvalho Filho⁶

¹Professor Doutor - Laboratório de Melhoramento Vegetal, Instituto Federal de Alagoas, Campus Piranhas, Piranhas, Alagoas; kd.agro@gmail.com; ²Doutora em Genética e Melhoramento de Plantas, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco; agrom1960@yahoo.com.br; ³Doutor em Genética e Melhoramento de Plantas, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro; prs_ufal@hotmail.com; ⁴Doutor em Fitopatologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco; adrianomfsilva@yahoo.com.br; ⁵Engenheiro Agrônomo, Universidade Federal Rural do Semi-Árido; eduardo.pereirasn@gmail.com; ⁶Professor Adjunto, Departamento de Agronomia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco; joseluiz.ufrpe@yahoo.com.br

Recebido para publicação em 27/11/2017; aprovado em 22/05/2017

Resumo: Objetivou-se identificar famílias F_2:3 de tomateiro homozigotas resistentes a Ralstonia pseudosolanacearum e Ralstonia solanacearum. Foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação da Universidade Federal Rural de Pernambuco sendo um para cada patógeno. Foram avaliados 45 tratamentos compostos pelas cultivares parentais Yoshimatsu (resistente) e IPA-7 (susceptível) e 43 famílias F_2:3 obtidas a partir da geração F₂. Cada tratamento foi constituído por 16 plantas. Foram avaliadas a incidência de murcha bacteriana por meio de uma escala descritiva de notas aos 20 dias após a inoculação. As famílias foram comparadas com os parentais de acordo com a frequência de plantas obtidas para cada nota. Foi realizado o teste qui quadrado () obtendo-se a significância em relação a cada um dos genitores. Para a espécie R. pseudosolanacearum foram identificadas três famílias homozigotas resistentes: Família F_2:3#04, Família F_2:3#29 e Família F_2:3#31. Com relação a espécie R. solanacearum foram identificadas duas famílias homozigotas resistentes: Família F_2:3#41 e Família F_2:3#42. Estas famílias indicam a possibilidade de novas linhagens resistentes que poderão ser utilizadas em programas de melhoramento.

Palavras-chave: Murcha bacteriana; Seleção; Solanum lycopersicum L.

Abstract: The objective of this work was to identify homozygous F_2:3 tomato families resistant to Ralstonia pseudosolanacearum and Ralstonia solanacearum. Two experiments were carried out under greenhouse conditions at the Federal Rural University of Pernambuco, one for each pathogen. We evaluated 45 treatments composed of Yoshimatsu (resistant) and IPA-7 (susceptible) and 43 families F_2:3 obtained from generation F₂. Each treatment consisted of 16 plants. The incidence of bacterial wilt was evaluated by means of a descriptive scale of notes at 20 days after inoculation. The families were compared with the parents according to the frequency of plants obtained for each note. The chi-square test () was obtained, obtaining the significance of each of the parents. For the species R. pseudosolanacearum three homozygous resistant families were identified: Family F_2:3 # 04, Family F_2:3 # 29 and Family F_2:3 # 31. Regarding R. solanacearum species, two homozygous resistant families were identified: Family F_2:3 # 41 and Family F_2:3 # 42. These families indicate the possibility of new resistant strains that can be used in breeding programs.

Keywords: Bacterial wilt; Selection; Solanum lycopersicum L.

INTRODUÇÃO

O tomateiro (Solanum lycopesicum L.) é uma das hortaliças mais cultivadas do mundo, sendo superada apenas pela batata inglesa (FAOSTAT, 2015). É uma das plantas de maior importância econômica, sendo destinada para mesa ou indústria. Na indústria, possui vários subprodutos, a exemplo do ketchup, extrato, polpa e pasta de tomate. Pode ser cultivada em diversos sistemas de cultivo a depender do destino da produção e dos recursos financeiros (MOREIRA et al., 2013).

Durante seu ciclo esta cultura é atacada por várias bacterioses, com destaque no Brasil para a murcha bacteriana causada por Ralstonia pseudosolanacearum e Ralstonia solanacearum (SANTIAGO et al., 2016). A nível mundial existem três espécies, além das duas citadas anteriormente, R. syzigii subsp. Indonesiensis que não ocorre no Brasil (PRIOR et al., 2016; ZHANG; QIU, 2016). A murcha bacteriana é uma das doenças mais destrutivas do tomateiro, podendo causar até 100% de perdas na produção. As espécies que causam esta doença apresentam uma ampla gama de hospedeiros e distribuição geográfica. Os métodos de controle consistem em evitar áreas infestadas e de microflora nativa; evitar transporte de partículas do solo contaminadas em calçados, implementos, ferramentas e na água de irrigação contaminada; incineração de plantas hospedeiras; rotação de culturas; aplicação de esterco e o controle genético. A utilização de cultivares resistentes é a melhor forma de controle por ser de menor custo, eficiente e ecologicamente menos impactante (DENNY, 2006; KIM et al., 2016).

Os resultados de estudos de herança disponíveis na literatura indicam que a natureza da resistência as espécies que causam a murcha bacteriana podem ser monogênica ou até mesmo poligênica (SHARMA; SHARMA, 2015). Há divergência de resultados também em relação ao grau médio de dominância e a interação entre os genes (MONMA et al., 1997; OLIVEIRA et al., 1999; LIMA NETO et al., 2002). Isso ocorre devido o uso de diferentes fontes de resistência, espécies e isolados dos patógenos, ambientes e interação entre estes fatores (LEBEAU et al., 2011). Os diferentes resultados influenciam na dificuldade para o desenvolvimento de novas cultivares.

A cultivar de tomateiro Yoshimatsu é resistente a murcha bacteriana mas tem frutos com baixa aceitação no mercado, e a cultivar IPA-7 é suscetível a murcha bacteriana mas apresenta frutos de qualidade (CAMPOS et al., 1998). Segundo Fiorini et al. (2007) é possível identificar famílias homozigotas resistentes e promissoras a partir de um cruzamento contrastante. Assim, a identificação preliminar de famílias F_2:3 homozigotas resistentes para cada espécie causadora da murcha bacteriana, pode fornecer base para a possível seleção de linhagens que combinem resistência e qualidade de frutos.

Nesse contexto objetivou-se com este trabalho identificar famílias F_2:3 de tomateiro homozigotas resistentes a R. pseudosolanacearum e R. solanacearum.

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação situada na latitude de 8°01'02"S e longitude de 34°56'41"O, localizada no Departamento de Agronomia da Universidade Federal Rural de Pernambuco (DEPA/UFRPE). O primeiro experimento foi realizado de 28/09/2016 a 26/11/2016, com temperatura média de 26,77°C e umidade relativa média de 70,12%. O segundo experimento foi realizado de 26/10/2016 a 12/12/2016, com temperatura média 27,38 °C e umidade relativa média de 69,78%.

As famílias F_2:3 foram obtidas na estação experimental do Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), localizada no município de Belém de São Francisco, Pernambuco, por meio de cruzamentos manuais entre genitores contrastantes em relação à resistência a murcha bacteriana. O genitor Yoshimatsu é cultivar desenvolvida pelo Instituto de Pesquisa da Amazônia (INPA) a partir do cruzamento entre IH-40 (IRAT-Guiana Francesa) com UH-7976 (Universidade de Hawaii). As plantas são de porte indeterminado, com frutos médios, pluriloculados e vermelhos, não sendo atrativos ao mercado. Apresenta resistência a murcha bacteriana (NICK; SILVA, 2016).

O genitor suscetível, IPA-7 é uma cultivar desenvolvida pelo IPA a partir de seleções realizadas na cultivar IPA-6. As plantas são de porte determinado, com frutos de médio a grandes, vermelhos e de boa aceitação no mercado. É susceptível a murcha bacteriana.

A técnica de cruzamento utilizada foi a mesma adotada pelo Instituto Agronômico de Pernambuco, onde o pólen do genitor masculino (IPA-7) foi extraído um dia antes, no período da tarde, sendo conservado em câmara fria. No genitor feminino (Yoshimatsu) cada flor foi emasculada em estádio de botão floral (um dia antes da antese), com uma pinça, retirando-se a corola com o cone de anteras, onde o cálice em geral também tem suas sépalas removidas (para servir de marcador). Após estas etapas poliniza-se e identifica-se cada flor individualmente.

De posse das sementes da geração F₁, foram plantadas em campo na estação 200 plantas para obter por autofecundação natural a geração F_2. Com as sementes, foram plantadas 500 plantas F₂, colhendo-se 500 famílias F_2:3, destas 43 foram utilizadas nos dois experimentos. Os frutos provenientes dos cruzamentos e das autofecundações foram colhidos maduros, as sementes foram extraídas manualmente, sendo lavadas em água corrente, secas à sombra e armazenadas em tubos falcon devidamente identificados.

Avaliação das famílias F_2:3

As 43 famílias F_2:3, juntamente com os genitores Yoshimatsu (Resistente) e IPA-7 (Suscetível) constituindo 45 tratamentos, foram avaliados para verificação da resistência a espécie R. Pseudosolanacearum em um primeiro experimento, e a resistência a R. solanacearum em um segundo experimento, utilizando os isolados CRMRs74 e CRMRs185 (Tabela 1), respectivamente.

Estes isolados são representativos para o Estado de Pernambuco. Em cada experimento foram avaliadas 16 plantas por família.

A semeadura foi realizada em bandejas de poliestireno expandido de 128 células, contendo substrato comercial. Cada célula possui o volume aproximado de 40 mL. Foram realizadas irrigações e fertirrigações de acordo com a necessidade para a formação de mudas de qualidade. Aos 21 dias após a semeadura as plantas foram transplantadas para vasos plásticos de 500 mL contendo substrato a base de uma mistura de solo e húmus na proporção de 3:1, respectivamente.

Para o preparo da suspensão bacteriana, os isolados foram recuperados da preservação em água e cultivados em meio TZC (tetracloreto de trifenil tetrazólio) (KELMAN, 1954) por 48h, a 30 °C ± 2 ºC. A suspensão bacteriana foi ajustada em fotocolorímetro (Analyser 500 M, Brasil) para A₅₇₀ = 0,54 que corresponde a 1x10⁸ UFC mL^-1.

Aos 30 dias após a semeadura (DAS), as plantas foram inoculadas pelo método do corte de raízes com deposição do inóculo, fazendo-se com auxílio de um bisturi um corte semicircular na mistura de solo próximo ao colo da planta, no qual foram depositados 15 ml da suspensão bacteriana (FELIX et al., 2012). Após a inoculação, as irrigações foram realizadas pelo método de subirrigação, que consiste em depositar água em recipientes plásticos localizados sob os vasos de 500 mL, a fim de não lixiviar o inóculo e de sempre manter o solo úmido. Foram mantidos dois turnos de rega, pela manhã e pela tarde.

As avaliações foram realizadas no 20° dia após a inoculação. A presença de incidência da doença foi mensurada com o auxílio de uma escala descritiva de notas variando de 1 a 5, adaptada de Nielsen e Haynes (1960), em que: 1 = ausência de sintomas; 2 = plantas com até 1/3 das folhas murchas; 3 = plantas com até 2/3 das folhas murchas; 4= plantas totalmente murchas e 5 = plantas mortas.

Por meio do ponto de truncagem (PT), as plantas de cada família e de cada genitor foram divididas em duas classes: a primeira foi representada pelas plantas com notas de murcha bacteriana aos 20 dias após a inoculação abaixo ou iguais ao ponto de truncagem e a segunda foi representada pelas plantas com notas acima ou iguais a este ponto, classificando-as como resistentes e suscetíveis, respectivamente.

A frequência de plantas para cada classe de cada família foi comparada com a frequência de plantas para cada classe dos genitores, através do teste não paramétrico qui quadrado () a 5% de probabilidade, utilizando a equação a seguir:

Em que: Fo_i= frequência observada; Fe_i= frequência esperada.

A família foi considerada homozigota resistente quando o teste apresentou resultado não significativo relativo ao ‘Yoshimatsu’ e significativo em relação ao ‘IPA-7’ indicou que a família era suscetível. A família segregante foi caracterizada pela significância do teste tanto para ‘Yoshimatsu’ quanto para ‘IPA-7’.

Para realizar os qui quadrado () foi utilizado o software GraphPad Instat versão 3.10 (INSTAT, 2009).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As distribuições de frequências de plantas e classes para famílias F_2:3 e de cada um dos seus genitores em relação a nota de murcha bacteriana causada por R. pseudosolanacearum estão apresentadas na Tabela 2.

A cultivar Yoshimatsu se apresentou imune a doença com as 16 plantas tendo nota 1. A cultivar IPA-7 teve um alto padrão de susceptibilidade com 6 plantas de nota 4, estando totalmente murchas, e 10 plantas com nota 5, mortas. Dessa forma observa-se o quanto os genitores são extremamente contrastantes, auxiliando assim na identificação das famílias. Alta resistência da cultivar Yoshimatsu também foi relatada por Souza e Gentil (2013) utilizando a mesma como porta enxertos.

As quarenta e três famílias F_2:3 avaliadas, permitem observar uma alta variabilidade no número de plantas obtidas para cada classe. Por meio do ponto de truncagem que foi a nota 2, para notas menores ou iguais a estas, o número mínimo de plantas foi de 1 nas Família F_2:3#08 e Família F_2:3#35, a um máximo de 13 plantas nas Família F_2:3#04, Família F_2:3#29 e Família F_2:3#31. Para plantas com notas maiores ou iguais a 3, ou seja, as que foram classificadas como susceptíveis, o número mínimo de plantas foi de 3 nas Família F_2:3#04, Família F_2:3#29 e Família F_2:3#31, a um máximo de 15 plantas nas Família F_2:3#8 e Família F_2:3#35.

Por meio da comparação das frequências de classes utilizando-se o teste não paramétrico qui quadrado () a 5% de probabilidade observou-se 3 famílias homozigotas resistentes, que foram identificadas por não diferirem da cultivar Yoshimatsu e diferirem da cultivar IPA-7, são estas: Família F_2:3#04, Família F_2:3#29 e Família F_2:3#31. Também foram identificadas 4 famílias homozigotas susceptíveis por não diferirem da cultivar IPA-7 e diferirem da cultivar Yoshimatsu, são estas: Família F_2:3#1, Família F_2:3#8, Família F_2:3#16 e Família F_2:3#35. As demais 36 famílias por diferirem significativamente de ambas as cultivares (Yoshimatsu e IPA-7), foram classificadas como segregantes para o caráter resistência a murcha bacteriana causada por R. pseudosolanacearum.

Na Tabela 3 encontram-se as distribuições de frequências de plantas e classes para famílias F_2:3 e de cada um dos seus genitores em relação a nota de murcha bacteriana causada por R. solanacearum.

Para esta espécie os genitores continuaram sendo bastante contrastantes, em que a cultivar Yoshimatsu se apresentou imune a doença com as 16 plantas com nota 1; e a cultivar IPA-7 continuou bem susceptível com 1 planta de nota 3, 7 plantas de nota 4, e 8 plantas com nota 5. R. pseudosolanacearum foi um pouco mais agressiva que R. solanacearum, pela observação das notas na culticar IPA-7.

Também identificou-se variabilidade no número de plantas obtidas para cada classe nas quarenta e três famílias F_2:3 avaliadas. Por meio do ponto de truncagem que foi a nota 2, para notas menores ou iguais a estas o número mínimo de plantas foi de 1 nas Família F_2:3#18, a um máximo de 13 plantas nas Família F_2:3#41 e Família F_2:3#42. Para plantas classificadas como susceptíveis, ou seja, as que obtiveram notas maiores ou iguais a 3, o número mínimo de plantas foi de 3 nas Família F_2:3#41 e Família F_2:3#42, a um máximo de 15 plantas apenas na Família F_2:3#18.

Por meio da comparação das frequências de classes utilizando-se o teste não paramétrico qui quadrado () a 5% de probabilidade observou-se duas famílias homozigotas resistentes, que foram identificadas por não diferirem da cultivar Yoshimatsu e diferirem da cultivar IPA-7, são estas: Família F_2:3#41 e Família F_2:3#42. Foram identificadas 7 famílias homozigotas susceptíveis por não diferirem da cultivar IPA-7 e diferirem da cultivar Yoshimatsu, são estas: Família F_2:3#04, Família F_2:3#06, Família F_2:3#09, Família F_2:3#17, Família F_2:3#18, Família F_2:3#31 e Família F_2:3#33. As 34 famílias restantes foram classificadas como segregantes para o caráter resistência a murcha bacteriana causada por R. pseudosolanacearum, por diferirem significativamente de ambas as cultivares (Yoshimatsu e IPA-7).

O número de famílias segregantes para R. pseudosolanacearum e R. solanacearum 36 e 34 foram respectivamente, muito próximos, da mesma forma aconteceu para homozigotos resistentes com três e duas famílias respectivamente. A pequena diferença está apenas na quantidade de homozigotos susceptíveis, em que R. solanacearum apresentou maior quantidade (7). Segundo Sharma e Sharma (2015) diferentes famílias homozigotas resistentes para as duas espécies podem ser explicadas devido ao possível controle genético da doença ser diferente.

Apesar da pequena quantidade de famílias homozigotas resistentes para cada uma das espécies causadoras da murcha bacteriana, estas indicam a possibilidade de novas linhagens que poderão originar novas cultivares a partir do programa de melhoramento. Segundo Huet (2014), existe uma grande diversidade dos patógenos causadores da murcha bacteriana, portanto, a identificação de famílias de tomateiro promissoras é de grande utilidade ao melhorista, uma vez que existe bastante interação patógeno x hospedeiro em relação ao ambiente em que o tomateiro será cultivado. Conforme Thakur et al. (2004), a herança da resistência a doença é recessiva, dessa forma as famílias indicadas não irão segregar durante os próximos ciclos de seleção. Além das famílias indicadas, existe bastante variabilidade nas que foram consideradas segregantes. Dependendo do controle genético da resistência, estas famílias também podem ser importantes fontes de resistência, principalmente se ocorrer dominância parcial no sentido da resistência como foi relatado por Oliveira et al. (1999) e Lima Neto (2002).

CONCLUSÕES

Para a espécie R. pseudosolanacearum foram identificadas três famílias homozigotas resistentes: Família F_2:3#04, Família F_2:3#29 e Família F_2:3#31. Com relação a espécie R. solanacearum foram identificadas duas famílias homozigotas resistentes: Família F_2:3#41 e Família F_2:3#42. Estas famílias indicam a possibilidade de novas linhagens resistentes que poderão ser utilizadas em programas de melhoramento.

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