NOTA CIENTÍFICA
Atividade antifúngica do extrato
etanólico de própolis vermelha contra isolados patogênicos de Candida spp.
The antifungal activity of
ethanol extract of red propolis against pathogenic isolates of Candida spp.
Actividad
antifúngica del extracto de
etanol de propóleos rojos contra aislados
patógenos de Candida spp.
Ana Laura de
Cabral Sobreira
1; Matheus Merson de Araújo Silva2; Luana Sayuri Okamura2;
Júlia Beatriz Pereira de Souza3; Egberto Santos Carmo3
1Doutoranda em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica
em Medicamentos, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba, lauracabralas@gmail.com; 2Farmacêutico(a),
Universidade Federal de Campina Grande, Cuité, Paraíba, +5583996584947, matheusmerson10@gmail.com; sayuriokamura1.1@gmail.com; 3Docentes,
Universidade Federal de Campina Grande, Cuité, Paraíba, juliabtriz@gmail.com; egbertosantos@ufcg.edu.br
Recebido: 16/05/2020; Aprovado: 16/09/2020
Resumo: A busca por novas substâncias antifúngicas se faz necessária, devido
ao aumento de casos de infecções fúngicas nos últimos anos, associado ao
aparecimento de cepas resistentes aos tratamentos convencionais e efeitos
adversos observados durante as terapias farmacológicas. Dentre estas infecções,
destacam-se as candidíases, como uma das mais comuns a acometerem os seres
humanos. Assim, objetivou-se avaliar o potencial antifúngico do extrato etanólico de própolis vermelha contra isolados patogênicos
de Candida spp. A determinação da Concentração Inibitória
Mínima (CIM) foi realizada pela técnica de microdiluição,
em placas de 96 cavidades, na qual verificou-se a sensibilidade de cepas de Candida spp. a concentrações do extrato de
própolis numa variação de 15.000 µg/mL a 29,3 µg/mL. Os valores de CIM foram determinados pela análise
visual da inibição do crescimento. Em seguida, adicionou-se cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) para determinação da Concentração
Fungicida Mínima (CFM). Todos os experimentos foram feitos em triplicata. A CIM encontrada variou de 234,4 µg/mL a 937,5 µg/mL, sendo a espécie
C. albicans, a mais sensível entre as
testadas. Observou-se que a CFM foi idêntica a CIM. A partir destes resultados,
conclui-se que o extrato etanólico de própolis
vermelha apresentou moderada atividade antifúngica sobre a maioria das cepas de
Candida spp., ratificando-se seu uso
tradicional quanto a suas propriedades antimicrobianas, as quais podem ser
melhor exploradas através de futuros estudos pré-clínicos e clínicos.
Palavras-chave: Candidíase; Infecção oportunista; Antimicrobiano.
Abstract: The search for new
antifungal substances is necessary, due to the increase in cases of fungal
infections in recent years, associated with the appearance of strains resistant
to conventional treatments and adverse effects observed during pharmacological
therapies. Among these infections, candidiasis stands out, as one of the most
common to affect humans. Thus, the objective was to evaluate the antifungal
potential of the ethanol extract of red propolis against pathogenic isolates of
Candida spp. The Minimum Inhibitory Concentration (MIC) was obtained by
using the microdilution, technique in 96-well plates, in which the sensitivity
of Candida spp. was evaluated at concentrations of propolis extract in a
range from 15,000 µg/mL to 29.3 µg/mL. MIC values
were determined by visual analysis of growth inhibition. Then, triphenyltetrazolium chloride (TTC) was added to determine
the Minimum Fungicidal Concentration (MFC). All experiments were performed in
triplicate. The MIC ranged from 234.4 µg/mL to 937.5 µg/mL, with the species C.
albicans being the most sensitive among those tested. The MFC was identical
to MIC. From these results, we concluded that the ethanol extract of red
propolis showed moderate antifungal activity on most strains of Candida
spp., confirming its traditional use regarding its antimicrobial properties,
which can be better explored through future pre-clinical and clinical studies.
Key
words: Candidiasis; Opportunistic infection; Antimicrobial.
Resumen: La búsqueda de nuevas sustancias antifúngicas es
necesaria, debido al
aumento de casos de infecciones fúngicas en los últimos años, asociadas con la
aparición de cepas resistentes a los
tratamientos convencionales
y efectos adversos observados durante las terapias farmacológicas. Entre estas infecciones, se destaca las candidiasis,
como una de las más comunes
para afectar a los humanos.
De esta forma, el objetivo fue
evaluar el potencial
antifúngico del extracto de
etanol del propóleo rojo
contra aislados patógenos de Candida
spp. La determinación de la
concentración inhibitoria
mínima (CIM) se realizó utilizando la técnica de microdilución, en placas de 96 pocillos, en las que la
sensibilidad de Candida
spp. a concentraciones de extracto
de propóleos en un rango de 15,000 µg/mL a 29.3
µg/mL. Los valores de MIC se determinaron
por análisis visual de la inhibición del crecimiento. Luego, se añadió cloruro de trifeniltetrazolio (TTC) para determinar la concentración mínima de fungicida
(CFM). Todos los experimentos se realizaron
por triplicado. El MIC encontrado varió de 234.4 µg/mL a 937.5 µg/mL, siendo las especies
C. albicans las más sensibles entre las analizadas. Se observó que CFM
era idéntico a CIM. A partir de estos
resultados, se concluye que
el extracto de etanol del propóleo rojo mostró una actividad antifúngica
moderada en la mayoría de las cepas de Candida spp., Confirmando su uso tradicional con respecto a sus propiedades
antimicrobianas, que pueden explorarse
mejor en el futuro estudios pre-clínicos y clínicos.
Palabras
Clave: Candidiasis; Infección oportunista; Antimicrobiano.
INTRODUÇÃO
Candida sp. é uma levedura comensal que habita diferentes
partes do nosso organismo como o trato gastrointestinal, mucosa oral e vagina,
considerada oportunista, que pode causar doenças no hospedeiro em situações de
desequilíbrio imunológico (BARBEDO; SARBI, 2010; BERNARDO; LIMA, 2015). Este
fungo causa a candidíase através de sua reprodução por brotamento, e dependendo
da espécie, pode formar como fatores de virulência, pseudo-hifas
e hifas, as quais facilitam a invasão aos tecidos. No meio de cultura, suas
colônias possuem coloração que varia de branca a creme e apresentam superfície
rugosa ou lisa (GIACOBINO, 2018).
Alguns
fatores predispõem o surgimento dessa micose, como contagem de linfócitos T-CD4
abaixo de 200 células/mm3, tabagismo, uso de terapia imunossupressora,
antibioticoterapia, procedimentos cirúrgicos, idade, desnutrição, higiene
precária, xerostomia e diabetes mellitus. Além de infecções superficiais, a Candida spp. pode desencadear infecções
sistêmicas que comprometem as vísceras como resultado da disseminação
hematogênica, sendo estas complicações infecciosas geralmente documentadas em
pacientes críticos, portadores de doenças degenerativas e/ou neoplásicas (CORRÊA,
2017; VIEIRA et al., 2018). De todas as espécies existentes do gênero,
destaca-se entre os isolados de amostras clínicas a espécie Candida albicans, correspondendo a 70-80% destas, prevalecendo em
infecções superficiais e invasivas (PANWAR FAUJDAR, 2016; BRANDOLT et al.,
2017; CASTANHEIRA et al., 2017).
Aproximadamente 80% da população adulta saudável
possui espécies de Candida no tubo
gastrointestinal. Entre as mulheres cerca de 20 a 30% apresentam colonização
por este fungo na vagina, e em hospitais, o gênero responde por
cerca de 80% das infecções fúngicas documentadas, representando um grande
desafio aos médicos de diferentes especialidades, devido às dificuldades
diagnósticas e terapêuticas das infecções acarretadas por tais agentes
(BARBEDOSGARBI, 2015; EMERIBE et al., 2015; BHESANIA e NARAYAKHEDKAR, 2017). Todavia
espécies não-albicans têm surgido como importantes patógenos oportunistas, com
predomínio de Candida glabrata,
Candida parapsilosis,
Candida tropicalis
e Candida krusei (CAMARGO
et al., 2015; GOULART et al., 2016; GLEHN et al., 2016; BRANDOLT et al., 2017).
Na atualidade, o tratamento de candidíase consiste na
administração de medicamentos, tanto tópicos quanto de uso sistêmicos, isolados
ou associados, conforme manifestações clínicas. Os fármacos comumente
empregados são os polienos como a anfotericina B, em variadas
formulações, os azólicos como o fluconazol,
cetoconazol e o voriconazol e as equinocandinas
(SIQUEIRA et al., 2015). Contudo, estes antifúngicos, especialmente de uso
sistêmico, possuem inúmeros efeitos adversos, podendo desencadear
nefrotoxicidade, hepatotoxicidade, reações de hipersensibilidade e ginecomastia
(JENSEN et al., 2015). Agravando o problema relacionado às infecções, muitas
cepas vêm desenvolvendo mecanismos de resistência aos tratamentos instituídos (NISHIMOTO;
SHARMA; ROGERS, 2020).
Diante destes problemas apresentados, fica evidente
que novos estudos envolvendo o desenvolvimento de fármacos antifúngicos são
necessários. Nesse sentido, a própolis, que apresenta um largo espectro de
atividades biológicas, incluindo antimicrobiana, é uma interessante candidata a
ter seu potencial antifúngico avaliado (BRASIL, 2018). Desta forma, no presente
estudo objetivou-se avaliar o potencial antifúngico do extrato etanólico da
própolis vermelha, frente a isolados patogênicos de Candida spp.
MATERIAL E
MÉTODOS
Foi realizada uma pesquisa do tipo experimental, cujos
testes de atividade antifúngica foram realizados no Laboratório de
Microbiologia do Centro de Educação e Saúde-CES, da Universidade Federal de
Campina Grande (UFCG), campus Cuité, Paraíba.
A matéria prima para realização dos testes
microbiológicos, foi o extrato etanólico de própolis vermelha (Apis Flora®), adquirido com recursos próprios em uma
farmácia localizada na cidade de Cuité, Paraíba. A concentração contida no
rótulo do produto era de 30% de própolis vermelha em sua composição. O lote do
produto é 000801418 e fabricação 24/09/18.
As leveduras que foram utilizadas nos ensaios foram
provenientes de isolados clínicos, de culturas feitas no setor de microbiologia
do laboratório de análises clínicas do Hospital Universitário Alcides Carneiro
(HUAC), sendo elas: Candida albicans HU-01; Candida
albicans ES-01; Candida
haemulloni SA-01; Candida
parapsilosis UR-01.
Quanto aos meios de cultura, utilizou-se o Ágar Sabouraud Dextrose
(ASD) para manutenção das leveduras teste e o caldo Sabouraud Dextrose
duplamente concentrado para os ensaios microbiológicos. Ambos foram preparados
de acordo com as instruções do fabricante (Kasvi®) sendo
solubilizados com água destilada e esterilizados em autoclave, a 121°C por 15
minutos.
Na preparação do inóculo fúngico, os isolados foram primeiramente cultivados
em meio ASD inclinado a 37°C por 24 horas (overnight). Inicialmente foram
preparadas suspensões dos microrganismos em tubos contendo salina estéril (NaCl a 0,85% p/v). Todas as suspensões foram agitadas por 2
minutos com auxílio do aparelho Vortex Biomixer. Após agitação, cada suspensão teve sua turbidez
comparada e ajustada, utilizando o aparelho Espectrofotômetro Bel Photonics SP 1102, para a transmitância de 70%, no
comprimento de onda de 530 nm, correspondendo
aproximadamente a 106 UFC/mL (SOUZA et al., 2007; MOREIRA et al.,
2010).
A determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi realizada
pela técnica de microdiluição, utilizando placas de microtitulação
contendo 96 cavidades com fundo em forma de “U” (SOUZA et al., 2007; MOREIRA et
al., 2010). Essa etapa foi determinada conforme recomendações da norma técnica
e M27-A2 do Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) ambas publicadas em 2002. Em cada orifício da placa de microdiluição
foram adicionados 100 µL do caldo Sabouraud Dextrose. Em seguida, 100 µL da
substância teste foram adicionados na primeira cavidade e diluições seriadas
sucessivas foram feitas, de forma que as concentrações variando de 15000 µg/mL
a 29,3 µg/mL fossem alcançadas. Em seguida, 10 µL da suspensão fúngica foram
adicionados a cada orifício da placa contendo o meio com produto, resultando em
uma concentração final de inóculo 105 UFC/mL.
Um controle de viabilidade do microrganismo foi realizado colocando-se
em determinadas cavidades 100 µL do meio sem os produtos teste com
microrganismos. Paralelamente, foi realizado o mesmo experimento com o
antifúngico cetoconazol. O cetoconazol foi dissolvido em dimetilsulfóxido
(DMSO) e diluído no meio de cultura até atingir 0,03 µg/mL a 16 µg/mL. Para o
controle da viabilidade do meio de cultura, foi dissolvido o DMSO (1%) no caldo
Sabouraud Dextrose, no intuito de confirmar que o DMSO não apresentaria
qualquer efeito inibitório. Ao final, todas as placas foram seladas e incubadas
a 37°C por um período de 24 a 48 horas.
Compreende-se a CIM como a menor concentração capaz de inibir 100% do
crescimento fúngico, sendo avaliada pela visualização da inibição do
crescimento em cada cavidade, comparando com o controle (ausente de drogas). Os
ensaios foram realizados em triplicata e o resultado expresso pela média
geométrica.
Por fim, determinou a Concentração Fungicida Mínima (CFM). Nesta última
etapa, foram adicionados 10 µL de cloreto de trifeniltetrazólio
(TTC) em cada cavidade, sendo a placa então incubada em estufa sob temperatura
de 37ºC durante um período de 2 horas, aproximadamente. Este agente químico
revela a atividade das enzimas desidrogenase envolvidas no processo de
respiração celular, através de uma reação entre suas propriedades químicas e o
microrganismo presente, assim distinguindo células vivas, que obtém coloração
avermelhada, das não viáveis, que mantem a sua cor (KUMAR; TARAFDAR, 2003).
Estes ensaios foram realizados em triplicata.
A análise estatística foi realizada a partir do software Statistical Package
for the Social Sciences,
versão 13.0. Os dados foram mensurados em µg/mL e houve a obtenção das médias.
Utilizou-se o teste U de Mann-Whitney, em que p<0,05 foi considerado
estatisticamente significativo para as hipóteses de nulidade.
A atividade de acesso ao patrimônio genético foi cadastrada no sistema
nacional de gestão do patrimônio genético e do conhecimento tradicional
associado (SisGen) em atendimento a Lei n°
13.123/2015, sob o número de cadastro A0D09C9.
RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Os resultados obtidos após as microdiluições para avaliação da
Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM),
demostraram que o extrato de própolis vermelha apresentou atividade
antifúngica, sendo capaz de inibir todas as cepas de Candida spp.
testadas, com uma CIM variando de 234,4 a 937,5 µg/mL (Tabela 1). Percebeu-se
ainda, conforme interação do sistema com TTC, que os valores da Concentração
Fungicida Mínima foram os mesmos da CIM.